Απρωτινίνη CAS 9087-70-1

Απρωτινίνη78R2S7, μοριακός τύπος C284H432N84O, CAS 9087-70-1, Είναι ένας αναστολέας πρωτεάσης που μπορεί να αναστείλει τη θρυψίνη και τη χυμοθρυψίνη, να αποτρέψει την ενεργοποίηση άλλων ενεργών πρωτεασωμάτων στο πάγκρεας και την αυτοενεργοποίηση του θρυψινογόνου. Χρησιμοποιείται κλινικά για την πρόληψη και τη θεραπεία της οξείας παγκρεατίτιδας, της αιμορραγίας που προκαλείται από ινωδόλυση και της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για αντισοκ θεραπεία. Οι αναστολείς πρωτεάσης είναι ουσίες που μπορούν να συνδεθούν με ένζυμα και να μειώσουν τον ρυθμό αποικοδόμησης του υποστρώματος. Οι αναστολείς πρωτεάσης με πρωτεϊνικές ιδιότητες είναι ευρέως παρόντες και δύο τύποι αναστολέων πρωτεάσης με πρωτεϊνικές ιδιότητες έχουν απομονωθεί από τη σόγια: ο αναστολέας θρυψίνης Kuniz και ο αναστολέας Baumann Bellck. Το πρώτο έχει μοριακό βάρος 20-25 ku, ενώ το δεύτερο έχει μοριακό βάρος 8 ku.

Ανασυνδυασμένοαπρωτινίνη(RTI16) μπορεί να αναστείλει την κινινάση και τη θρυψίνη και είναι ένας φυσικός μη-αναστολέας πρωτεάσης σερίνης. Είναι μια βασική πρωτεΐνη μονής αλυσίδας που αποτελείται από 58 υπολείμματα αμινοξέων, με 3 δισουλφιδικούς δεσμούς διασταυρούμενους-στην αλυσίδα. Για μεγάλο χρονικό διάστημα, η απρωτίνη έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της οξείας παγκρεατίτιδας. Μετά τη δεκαετία του 1990, η ανασυνδυασμένη απρωτίνη άρχισε να χρησιμοποιείται στην καρδιοθωρακική χειρουργική για την προστασία των αιμοπεταλίων, τη μείωση της αιμορραγίας και της εξίδρωσης και για την κλινική θεραπεία ασθενών με διαταραχές πήξης. Ως εκ τούτου, το μέγεθος της αγοράς της απρωτίνης έχει επεκταθεί γρήγορα και έχει γίνει ένα από τα σημαντικά βιοχημικά φάρμακα.

Σύνθεση

 

Επί του παρόντος, τα εμπορικά διαθέσιμα παρασκευάσματα ανασυνδυασμένης απρωτίνης είναι κυρίως εκχυλίσματα από όργανα όπως οι πνεύμονες βοοειδών, τα οποία έχουν πολύπλοκες διαδικασίες και υψηλό κόστος. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να διερευνηθεί η παραγωγή ανασυνδυασμένης απρωτίνης χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής.

Όταν χρησιμοποιείται ένα σύστημα έκφρασης έκκρισης, η παραγωγή απρωτίνης είναι γενικά χαμηλή και η δραστικότητα του προκύπτοντος προϊόντος είναι επίσης χαμηλή. Μέσω της έκφρασης σύντηξης, αναμένεται να αυξηθεί πολύ το επίπεδο έκφρασης της ανασυνδυασμένης απρωτίνης.

 

Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε ένα πλασμίδιο έκφρασης ανασυνδυασμένης απρωτίνης pGrxA BPTI και σχεδιάστηκε μια θέση αναγνώρισης για το FXa μεταξύ του συνεργάτη σύντηξης και της ανασυνδυασμένης απρωτίνης. Αφού εκφράστηκε με τη μορφή σώματος εγκλεισμού, ο συνεργάτης σύντηξης καθαρίστηκε και αναδιπλώθηκε με διήθηση γέλης. Ο συνεργάτης σύντηξης αποκόπηκε με FXa για να ληφθεί μια πρωτεΐνη με την ίδια δράση με το φυσικό προϊόν. Μέσω της βελτιστοποίησης των συνθηκών έκφρασης, η απόδοση βελτιώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με προηγούμενα συστήματα έκφρασης.

Βελτιστοποίηση έκφρασης βακτηρίων μηχανικής:

 

Εμβολιάστε τα βακτήρια σωλήνων γλυκερόλης σε τρυβλία άγαρ LB/AMP, καλλιεργήστε στους 37 βαθμούς για 20 ώρες, ξύστε τις αποικίες και ενοφθαλμίστε τις σε 5 mL υγρού μέσου LB/AMP στους 37 βαθμούς, 200 r/min και καλλιεργήστε όλη τη νύχτα. Εμβολιάστε το 5% του εμβολίου σε 100 mL μέσου πολτού καλαμποκιού, καλλιέργησε στους 37 βαθμούς και 220 r/min σε αναδευτήρα, επαγωγή για 7 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε (8000 r/min, 5 λεπτά, 4 βαθμοί) για τη συλλογή των βακτηριακών κυττάρων. Ζυγίστε το υγρό βάρος των βακτηριακών κυττάρων και ανιχνεύστε την έκφρασή τους κατά 15% SDS-PAGE.

Καλλιέργεια δεξαμενής ζύμωσης

 

Καλλιέργεια δεξαμενής ζύμωσης:

Χρησιμοποιώντας ένα γερμανικό δοχείο ζύμωσης Biostat 30 L, στους 37 βαθμούς, με διαλυμένο οξυγόνο ελεγχόμενο στο 20%, pH 7,0. Χρησιμοποιώντας μια δεξαμενή ζύμωσης για την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης, ελήφθησαν 260 g υγρών βακτηριακών κυττάρων από 16 L ζωμού ζύμωσης, περίπου 16 g/L. Το επίπεδο έκφρασης είναι περίπου 45%,

Σπάσιμο τοιχώματος και απόκτηση βακτηριακών κυττάρων από σώμα εγκλεισμού:

 

Αφού ολοκληρωθεί η καλλιέργεια, συλλέξτε τα βακτηριακά κύτταρα, προσθέστε 1 g βακτηριακών κυττάρων σε 10 mL διαλύματος Α (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA), εναιωρήστε τα καλά, υποβάλετε σε υπερήχους τα κύτταρα σε παγόλουτρο, εργαστείτε για 30 δευτερόλεπτα, διάστημα 30 δευτερόλεπτα, ισχύς 10 δευτερόλεπτα, κύκλος. Μεταφέρετε το υγρό σε σωλήνα φυγοκέντρησης, φυγοκεντρήστε στις 4 μοίρες και 8000 r/min για 15 λεπτά, και το ίζημα είναι το ακατέργαστο σώμα εγκλεισμού.

Παρασκευή διαλύματος διάλυσης σώματος εγκλεισμού:

 

Πλύνετε το ακατέργαστο σώμα εγκλεισμού με διάλυμα Β (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 1 mmol/L EDTA, 1% Triton-X100) δύο φορές, κάθε φορά για 0,5 ώρες, φυγοκεντρήστε για να αφαιρέσετε το υπερκείμενο και λάβετε σχετικά καθαρά σώματα εγκλεισμού. Προσθέστε 1 g σωμάτων εγκλεισμού σε 5 mL διαλύματος C (50 mmol/L Tris HCl, pH 8,0, 8 mol/L ουρίας, 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L DTT), επωάστε όλη τη νύχτα στους 4 βαθμούς, μετουσιώστε και διαλύστε, φυγοκεντρήστε 05 rnat/min για 12 λεπτά. διάλυμα διάλυσης σώματος εγκλεισμού. Λάβετε ανασυνδυασμένη απρωτίνη.

Φαρμακολογικές επιδράσεις:

 

 

Απρωτινίνηαναστέλλει την ανθρώπινη θρυψίνη, το ινωδολυτικό ένζυμο, την αγγειοτενσίνη του πλάσματος και των ιστών μέσω συμπλοκών αναστρέψιμων αναστολέων ενζύμου που σχηματίζονται σε μια ορισμένη χημική αναλογία. Οι πρωτεάσες με δραστηριότητα σερίνης παίζουν σημαντικό ρόλο στο σύστημα κινινογόνου αγγειοπιεσίνης, στο σύστημα του συμπληρώματος και στο σύστημα πήξης, όπου η πλασμίνη και η αγγειοπιεσίνη πλάσματος παίζουν κρίσιμους ρόλους.

 

Η απρωτίνη ασκεί την ανασταλτική της δράση σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο πρωτεάσης απροτινίνης μέσω του ενεργού τμήματος σερίνης στο ένζυμο. Ωστόσο, όταν συνδυάζεται με διαφορετικές πρωτεάσες, εμφανίζει διαφορετικές σταθερές διάστασης. Η δέσμευση με τη θρυψίνη είναι η ισχυρότερη (Ki=0.06nmoN), η οποία είναι μία από τις χαμηλότερες σταθερές που αναφέρονται στις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-(Laydunski et al. 1974). Η σύνδεση με το ανθρώπινο ινωδολυτικό ένζυμο δεν είναι πολύ ισχυρή. Λόγω της υψηλής τιμής Κ του συμπλέγματος αναστολέα ενζύμου (Ki=1 nmoN), μπορεί να είναι αναστρέψιμο (Wimann, 1980) και το σύμπλοκο που συνδέεται με την αγγειοτασίνη του ανθρώπινου πλάσματος είναι αρκετά αδύναμο (Ki=30 nmol/l), αλλά εξακολουθεί να βρίσκεται εντός του θεραπευτικού εύρους της απροτινίνης38,9 (N).

 

Η απρωτίνη δεν συνδέεται μόνο με μόρια ελεύθερων ενζύμων, αλλά και σε ένζυμα που έχουν ήδη δεσμευτεί σε ένα τρίτο συστατικό (εάν το ενεργό κέντρο του ενζύμου εξακολουθεί να έχει ικανότητα δέσμευσης). Ως εκ τούτου, η απρωτίνη αναστέλλει τα ελεύθερα ινωδολυτικά ένζυμα και μπορεί επίσης να αναστείλει το σύμπλεγμα ενδιάμεσης αλυσίδας κινάσης ινωδολυσίνης που σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της θρομβολυτικής θεραπείας με αλυσιδωτή κινάση (Wimann, 1980).
Η αντιινωδολυτική δράση της απρωτίνης βασίζεται στην αναστολή της πλασμίνης που ενεργοποιείται από την υδρόλυση πρωτεϊνών. Σε αντίθεση με τους συνθετικούς αντιινωδολυτικούς διαλύτες, λόγω της άμεσης αναστολής της υπερενεργοποιημένης πλασμίνης, η απρωτίνη όχι μόνο προστατεύει το άμεσο υπόστρωμα (ινώδες) από την αποικοδόμηση από την πλασμίνη, αλλά προστατεύει επίσης το ινωδογόνο, τους παράγοντες V και VIII στο πλάσμα και την άλφα 2-σφαιρίνη στον ορό.

 

Στα πειράματα του σοκ που προκαλείται από ενδοτοξίνες και του υποογκαιμικού σοκ, η Trasylol μπορεί να αναστείλει σημαντικά την ενεργοποίηση του κινινογόνου. (Massion et a1 (1972).
Η τρασυλόλη μπορεί να αποτρέψει ή να καθυστερήσει την ανάπτυξη πνευμονικού διάμεσου οιδήματος (πνεύμονα καταπληξίας). Η ανασταλτική του δράση εξαρτάται από τη δόση και το χρόνο- (Lorthioir et al., 1973).
Κατά τη διάρκεια του σοκ, το ισχαιμικό πάγκρεας μπορεί να παράγει μια εξαιρετικά τοξική πεπτιδική ουσία, δηλαδή τον ανασταλτικό παράγοντα του μυοκαρδίου (MDF). Αυτός ο παράγοντας σχετίζεται στενά με το θάνατο από σοκ.

 

Το MDF μπορεί να ανιχνευθεί στο πλάσμα ποντικών, σκύλων, πιθήκων και ανθρώπων με αιμορραγικό, σηπτικό, καρδιογενές σοκ και έγκαυμα. Το MDF μπορεί να προκαλέσει μείωση της συσταλτικότητας του μυοκαρδίου σε όλες τις περιπτώσεις αιμορραγίας και ταυτόχρονα προκαλεί συστολή αγγείων σπλαχνικής αντίστασης, οδηγώντας σε τοπική ισχαιμία και παραγωγή περισσότερων MDF. Επιπλέον, λόγω της τοξικής βλάβης που προκαλείται στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα, η κάθαρσή του στην κυκλοφορία του αίματος καθυστερεί. Η τρασυλόλη μπορεί να εμποδίσει σε μεγάλο βαθμό την παραγωγή MDF (Lefer 1984).

Απρωτινίνη, ως ένωση μικρού μορίου που ανθίσταται στην ινωδόλυση, εμφανίζει σημαντικές και ειδικές ανασταλτικές ιδιότητες ενζύμων. Όχι μόνο αναστέλλει αποτελεσματικά τη δραστηριότητα της θρυψίνης, αλλά δρα επίσης εκτενώς σε άλλα σχετικά πρωτεολυτικά ένζυμα, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο σε πειράματα κυτταρικής βιολογίας. Ειδικά κατά τη λύση και την ομογενοποίηση κυττάρων και ιστών, το Aprotinn μπορεί να χρησιμεύσει ως αποτελεσματικός αναστολέας πρωτεάσης, αποτρέποντας αποτελεσματικά την τυχαία αποικοδόμηση των πρωτεϊνών-στόχων, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της ακρίβειας του δείγματος.

Η ανασταλτική δράση του Aprotinn δείχνει μια σαφή εξάρτηση από τη δόση, δηλαδή, καθώς αυξάνεται η συγκέντρωσή του, αυξάνεται ανάλογα και η ανασταλτική δράση στην ινωδολυτική δραστηριότητα. Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει στους ερευνητές να ελέγχουν με μεγαλύτερη ακρίβεια τις πειραματικές συνθήκες για να αποκτήσουν πιο αξιόπιστα και αναπαραγώγιμα πειραματικά αποτελέσματα. Εν τω μεταξύ, το Aprotinn μπορεί επίσης να παρατείνει το χρόνο πήξης του αίματος, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τον σημαντικό ρόλο του στον μηχανισμό πήξης. Πειράματα in vitro έδειξαν ότι το Aprotinn είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας της ενδογενούς οδού πήξης που μπορεί να παρεμβαίνει και να ρυθμίζει βασικές διεργασίες στη διαδικασία πήξης.

Η Απρωτίνη έχει επίσης επιδείξει τις μοναδικές της φαρμακολογικές επιδράσεις. Μπορεί να αναστείλει σημαντικά τη διαδικασία διάλυσης του θρόμβου αίματος in vitro, να παρατείνει τον χρόνο αιμορραγίας της κοπής της ουράς σε αρουραίους και να παρατείνει το χρόνο πήξης στο ανθρώπινο πλάσμα. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι το Aprotinn μπορεί να έχει πιθανά αντιαιμορραγικά και αντιθρομβωτικά αποτελέσματα. Για να επικυρώσουν περαιτέρω την in vivo επίδρασή του, οι ερευνητές διεξήγαγαν πειράματα σε ένα μοντέλο αρτηριοφλεβικού βραχυκυκλώματος αρουραίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Aprotnin μπορεί να μειώσει σημαντικά το βάρος των θρόμβων αίματος, υποστηρίζοντας περαιτέρω τις δυνατότητές του ως αντιθρομβωτικό φάρμακο.

Συνοπτικά, η απροτνίνη, ως ένωση μικρού μορίου που αναστέλλει την ινωδόλυση, έχει επιδείξει σημαντικές ανασταλτικές ιδιότητες ενζύμων και φαρμακολογικές επιδράσεις τόσο in vitro όσο και in vivo. Η εφαρμογή του σε πειράματα κυτταρικής βιολογίας παρέχει στους ερευνητές ισχυρά εργαλεία, ενώ τα ευρήματά του σε μελέτες in vivo παρέχουν σημαντικές ενδείξεις και βάση για την ανάπτυξή του ως αντιαιμορραγικό και αντιθρομβωτικό φάρμακο. Στο μέλλον, με περαιτέρω έρευνα για τον μηχανισμό δράσης του Aprotnin και κλινικές δοκιμές, αναμένεται να δούμε ευρύτερη εφαρμογή του στον ιατρικό τομέα.

Δημοφιλείς Ετικέτες: aprotinin cas 9087-70-1, προμηθευτές, κατασκευαστές, εργοστάσιο, χονδρική, αγορά, τιμή, χύμα, προς πώληση