ΟΕΠ%7β%7β0%7δ%7δ(Σύνδεσμος:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) είναι μια πολυπεπτιδική ορμόνη που αποτελείται από 30 αμινοξέα. Με τη εις βάθος έρευνα για την GLP-1, έχουν αναπτυχθεί όλο και περισσότερες συνθετικές μέθοδοι. Αυτό το άρθρο θα εισαγάγει συστηματικά τις επί του παρόντος γνωστές μεθόδους σύνθεσης του GLP-1.
Μέθοδος 1, σύνθεση στερεάς φάσης:
Η σύνθεση στερεάς φάσης είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τη σύνθεση πεπτιδίων και πρωτεϊνών και χρησιμοποιείται επίσης συνήθως για τη σύνθεση του GLP-1. Στη σύνθεση στερεάς φάσης, η δομή του πυρήνα σχηματίζεται συνδέοντας το πρώτο αμινοξύ με τη ρητίνη. Στη συνέχεια, το επόμενο αμινοξύ προστίθεται διαδοχικά και αντιδρά χημικά με έναν κατάλληλο παράγοντα συμπύκνωσης. Τέλος, το προϊόν στόχος μπορεί να ληφθεί με διάσπαση του πολυπεπτιδίου από τη ρητίνη.
Η σημασία της σύνθεσης στερεάς φάσης είναι ότι επιτρέπει την αυτοματοποίηση και την παραγωγή μεγάλης κλίμακας της σύνθεσης πεπτιδίων. Οι τρέχουσες κύριες μέθοδοι σύνθεσης στερεάς φάσης περιλαμβάνουν Fmoc και Boc. Μεταξύ αυτών, η μέθοδος Fmoc χρησιμοποιεί την προστατευτική ομάδα N-Fmoc για την προστασία του πεπτιδίου, ενώ η μέθοδος Boc χρησιμοποιεί tert-βουτυλοξυκαρβονύλιο για την προστασία της καρβοξυλικής ομάδας.
Μέθοδος δεύτερη, σύνθεση υγρής φάσης:
Η σύνθεση υγρής φάσης είναι μια παραδοσιακή μέθοδος σύνθεσης πεπτιδίων στην οποία τα αντιδρώντα τοποθετούνται στην υγρή φάση για την αντίδραση. Το πλεονέκτημα της σύνθεσης υγρής φάσης είναι ότι οι συνθήκες αντίδρασης είναι ήπιες και κατάλληλες για την τροποποίηση ευαίσθητων χημικών δομών. Ωστόσο, λόγω πάρα πολλών αντιδραστηρίων, η διαδικασία καθαρισμού είναι σχετικά επίπονη. Οι χημικές αντιδράσεις στη σύνθεση υγρής φάσης περιλαμβάνουν:
1. Αντίδραση συμπύκνωσης:
Η αντίδραση συμπύκνωσης είναι μια από τις πιο βασικές αντιδράσεις στη σύνθεση πεπτιδίων, δηλαδή, η καρβοξυλική ομάδα που ξεκινά από παράγοντες συμπύκνωσης όπως DCC και HOBt συνδέεται με την αμινομάδα του αμινοξέος μέσω της αντίδρασης ακυλίωσης. Οι συνθήκες αντίδρασης είναι ήπιες και η απόδοση είναι υψηλή.
2. Αντιδράσεις αποβολής:
Η αντίδραση απομάκρυνσης είναι η αναγωγή της μεθειονίνης στη διθειόλη με NaBH4 και άλλους αναγωγικούς παράγοντες, καθιστώντας την ανενεργή. Η αντίδραση πρέπει να πραγματοποιηθεί υπό βασικές συνθήκες.
3. Αφαίρεση προστατευτικών ομάδων:
Λόγω των διαφορετικών λειτουργιών των αμινοξέων στην πεπτιδική αλυσίδα, θα χρησιμοποιηθούν διαφορετικές προστατευτικές ομάδες για προστασία. Αφού ολοκληρωθεί η σύνθεση, πρέπει να αφαιρεθεί η προστατευτική ομάδα. Για τη μέθοδο Fmoc, η πιπεριδίνη χρησιμοποιείται συνήθως για την αφαίρεση του Fmoc. ενώ για τη μέθοδο Boc, το TFA χρησιμοποιείται για την αφαίρεση του Boc.
Τρίτη μέθοδος, χημική σύνθεση:
Το GLP-1 είναι μια πολυπεπτιδική ορμόνη με σημαντικές βιολογικές δραστηριότητες. Η σύνθεσή του μπορεί να πραγματοποιηθεί με διάφορες μεθόδους, μεταξύ των οποίων η χημική σύνθεση είναι μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους. Το πλεονέκτημα της χημικής σύνθεσης είναι ότι μπορεί να παράγει προϊόντα-στόχους υψηλής καθαρότητας, τα οποία είναι κατάλληλα για παραγωγή μεγάλης κλίμακας. Η μέθοδος χημικής σύνθεσης και τα λεπτομερή βήματα του GLP-1 θα παρουσιαστούν παρακάτω.
1. Συνθετική διαδρομή και επιλογή ομάδας προστασίας:
Το μόριο GLP-1 αποτελείται από 36 αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένων 21 αμινοξέων τύπου L και 15 τύπου D. Πριν από τη διεξαγωγή της σύνθεσης, είναι απαραίτητο να επιλέξετε μια κατάλληλη συνθετική οδό και να επιλέξετε την αντίστοιχη προστατευτική ομάδα σύμφωνα με τις συνθετικές συνθήκες. Η σύνθεση στερεάς φάσης Fmoc χρησιμοποιείται συνήθως για αυτοματοποιημένη σύνθεση μεγάλης κλίμακας. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιεί Ν-9-φθοροϊμιδο καρβοξυλική προστασία (N-Fmoc) ως προστατευτική ομάδα και πρέπει επίσης να επιλέξει μια κατάλληλη δευτερεύουσα προστατευτική ομάδα (όπως τριτ-βουτύλιο ή μεθύλιο) για να διασφαλίσει την προστασία συγκεκριμένων θέσεων. Κάθε φορά που προστίθεται ένα νέο αμινοξύ, πρέπει πρώτα να αφαιρείται η προστατευτική ομάδα Fmoc και στη συνέχεια να προστίθεται η προστατευμένη ουσία σύζευξης του επόμενου αμινοξέος.
2. Σύνθεση της βασικής αλληλουχίας αμινοξέων:
Η βασική αλληλουχία του GLP-1 αποτελείται από 21 αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένης μιας βασικής σερίνης και τεσσάρων διπεπτιδικών αλληλουχιών προλυλ-γλουταμινικού οξέος. Στη σύνθεση στερεάς φάσης, η σύνθεση της αλληλουχίας πυρήνα μπορεί να χωριστεί στα ακόλουθα βήματα:
2.1. Προσθέστε καρβαμικό οξικό οξύ (Fmoc-NH-CH2CO2Et) και 2-Cl-Trt-Cl σε συνθετική ρητίνη στερεάς φάσης και εκτελέστε αντίδραση συμπύκνωσης με παράγοντα σύζευξης DIC/NMM.
2.2. Αφαιρέστε την προστατευτική ομάδα Fmoc αποπροστατεύοντας την ομαδική αντίδραση.
2.3. Προσθέστε το επόμενο αμινοξύ, επαναλάβετε το βήμα 1 και το βήμα 2 με τη σειρά μέχρι να συντεθεί η αλληλουχία πυρήνα.
2.4. Σχηματισμός πενταπεπτιδικών δομών σε ρητίνη στερεάς φάσης. Προσθέστε το αντιδραστήριο ακεταλίωσης στη ρητίνη στερεάς φάσης, αντιδράστε με τον παράγοντα αναγνώρισης Ν-τερματικού (όπως HBTU), προσθέστε την ομάδα προστασίας πλευρικής αλυσίδας της σερίνης ως βοηθητικό αναγωγικό παράγοντα και, στη συνέχεια, αφαιρέστε την ομάδα προστασίας Fmoc.
2.5. Κάτω από την κατάλυση της τρανσφεράσης Bacillus subtilis (ProTide), η πενταπεπτιδική δομή υφίσταται αντίδραση ανταλλαγής με τον πρόδρομο της ιωδοοξικής σερίνης.
3. Σύνθεση της υπόλοιπης αλληλουχίας αμινοξέων:
Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης της αλληλουχίας πυρήνα, είναι απαραίτητο να συνεχιστεί η προσθήκη των υπόλοιπων αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένων των αμινοξέων τύπου L- και D. Η προσθήκη αυτών των αμινοξέων πρέπει να ξεκινήσει από την αλληλουχία πυρήνα, να προστεθεί το επόμενο αμινοξύ στη σειρά και να χρησιμοποιηθεί ο αντίστοιχος παράγοντας συμπύκνωσης για τη διεξαγωγή χημικών αντιδράσεων μέχρι να συντεθεί ένα πλήρες μόριο πολυπεπτιδίου GLP-1. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, είναι επίσης απαραίτητο να επιλεγεί μια κατάλληλη προστατευτική ομάδα όπως απαιτείται, και να πραγματοποιηθούν τα στάδια της αντίδρασης, η αφαίρεση της προστατευτικής ομάδας και η προσθήκη αμινοξέος με τη σειρά.
4. Επεξεργασία υδροξειδίου του νατρίου:
Αφού προστεθούν όλα τα αμινοξέα, μια ατελώς συντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα σχηματίζεται στη ρητίνη στερεάς φάσης και πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία για να σχηματιστεί ένα πλήρως σχηματισμένο πεπτιδικό μόριο. Πρώτον, το ασχηματισμένο πεπτίδιο θα πρέπει να υδρολύεται με υδροξείδιο του νατρίου, έτσι ώστε η καρβοξυλική ομάδα C-τερματική που αρχικά ήταν συνδεδεμένη με τη ρητίνη να αποσπαστεί από τη ρητίνη και η προστατευτική ομάδα να αποκολληθεί σε νερό. Μετά την αντίδραση υδρόλυσης, λαμβάνεται το προϊόν στόχος.
5. Καθίζηση και πλύσιμο:
Μετά την επεξεργασία, το υδρολυμένο διάλυμα υποβάλλεται σε επεξεργασία με οξύ για να καταβυθιστεί το προϊόν-στόχος. Στη συνέχεια, το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε νερό, ακολουθούμενο από εντατική πλύση για την απομάκρυνση των ακαθαρσιών.
6. Καθαρισμός:
Το τελικό βήμα είναι ο καθαρισμός του επιθυμητού προϊόντος, συνήθως χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, η καθαρότητα του προϊόντος μπορεί να προσδιοριστεί ανιχνεύοντας την κορυφή του διαλύματος στο φάσμα μάζας. Εν ολίγοις, η χημική σύνθεση του GLP-1 απαιτεί πολλαπλούς γύρους πολύπλοκων αντιδράσεων και αυστηρών διαδικασιών καθαρισμού για να ληφθεί τελικά το ενεργό προϊόν-στόχος.
Μέθοδος τέταρτη, βιοσύνθεση:
Το GLP-1 είναι μια σημαντική πολυπεπτιδική ορμόνη με διάφορες φυσιολογικές επιδράσεις, όπως η προαγωγή της έκκρισης ινσουλίνης, η καταστολή της όρεξης, η μείωση του σωματικού βάρους και η διατήρηση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη κ.λπ. Η μέθοδος βιοσύνθεσης του GLP-1 συντίθεται κυρίως από κύτταρα L στον παγκρεατικό αδένα, και ο ρυθμός σύνθεσής του ρυθμίζεται με τη διαιτητική πρόσληψη. Τα αναλυτικά βήματα παρουσιάζονται ως εξής:
1. Προπαρασκευαστικές εργασίες πριν από τη σύνθεση:
Πριν από τη βιοσύνθεση του GLP-1, χρειάζεται να γίνει κάποια προπαρασκευαστική εργασία, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του χρησιμοποιούμενου τύπου κυττάρου, του καθορισμού των συνθηκών καλλιέργειας και της επιλογής του κατάλληλου καταλυτικού ενζύμου. Τα κύτταρα L είναι η κύρια πηγή σύνθεσης GLP-1 επειδή περιέχουν πρόδρομες ουσίες δύο ορμονών, της GIP (πεπτίδιο 1 που μοιάζει με γλυκαγόνο) και της GLP-1. Τα κύτταρα L μπορούν να απομονωθούν από το εντερικό επιθήλιο κουνελιών ή ποντικών. Πριν από τη βιοσύνθεση, τα κύτταρα πρέπει να καλλιεργηθούν σε επαρκή αριθμό και να παρέχονται επαρκή θρεπτικά συστατικά και κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να επιλεγεί το κατάλληλο καταλυτικό ένζυμο για την προώθηση της αντίδρασης.
2. Σύνθεση και επεξεργασία προδρόμων ουσιών:
Η βιοσύνθεση του GLP-1 συμβαίνει κυρίως στα κύτταρα L και ο πρόδρομός του αποτελείται από δύο ορμόνες, την GIP και την GLP-1. Μετά την είσοδο στα ενδοκρινικά κύτταρα, το GIP και το GLP-1 υποβάλλονται σε επεξεργασία από πρωτεολυτικά ένζυμα και διασπώνται σε μεμονωμένα πεπτίδια. Μια σειρά από ένζυμα και συμπαράγοντες εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία, συμπεριλαμβανομένης της πρόδρομης πολυπεπτιδικής οξάσης (PC2), της ισομεράσης και των παραγόντων όψιμης προσκόλλησης.
3. Αμοιβαία μετατροπή μεταξύ πολυπεπτιδικών τμημάτων:
Μετά την επεξεργασία, τα πεπτίδια GIP και GLP-1 ανασυνδυάζονται για να σχηματίσουν το πολυπεπτίδιο GLP-1. Αυτή η διαδικασία απαιτεί τη χρήση του πεπτιδίου 1 που μοιάζει με γλυκαγόνο (GLP-1) ως πρότυπο στο οποίο συνδυάζονται άλλα μεμονωμένα πεπτίδια για να σχηματίσουν νέα σύνθετα πολυπεπτίδια. Αυτή η διαδικασία απαιτεί επίσης ορισμένα συγκεκριμένα ένζυμα και παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της προορμόνης κονβερτάσης 1/3 (PC1/3) και της καρβοξυπεπτιδάσης Ε (CPE).
4. Έκκριση GLP-1:
Αφού το GLP-1 συντεθεί και υποβληθεί σε επεξεργασία, αποθηκεύεται στο κυτταρόπλασμα και στα εσωτερικά κυστίδια των ενδοκρινικών κυττάρων. Όταν διεγείρονται από τη διατροφή, τα ενδοκρινικά κύτταρα απελευθερώνουν GLP-1 και εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος μέσω των μικροαγγείων. Αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται και ελέγχεται μέσω μιας σειράς οδών μεταγωγής σήματος, συμπεριλαμβανομένου του cAMP-Ca2 συνκαι ούτω καθεξής.
Εν ολίγοις, η βιοσύνθεση του GLP-1 περιλαμβάνει την κοινή δράση πολλών συνδέσμων και παραγόντων. Ο συνδυασμός βιοσύνθεσης και χημικής σύνθεσης μπορεί να προσφέρει καλύτερη βάση και υποστήριξη για την έρευνα και την παραγωγή GLP-1.
Μέθοδος πέμπτη, ενζυματική σύνθεση:
Η ενζυματική σύνθεση είναι η σύνθεση πεπτιδικών αλυσίδων μέσω της κατάλυσης βιολογικών ενζύμων. Σε σύγκριση με τις παραδοσιακές μεθόδους σύνθεσης υγρής φάσης, η ενζυματική σύνθεση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου και μπορεί να επιλεγεί ένα ευρύ φάσμα πρώτων υλών. Για την κατάλυση της σύνθεσης χρησιμοποιούνται συνήθως ένζυμα όπως η θήτα-υγρή συνθάση, AEP, ACE κ.λπ.
Συμπερασματικά, οι προαναφερθείσες μέθοδοι είναι εφικτές μέθοδοι για τη σύνθεση GLP-1. Διαφορετικές μέθοδοι είναι κατάλληλες για διαφορετικές πειραματικές συνθήκες και περιβάλλοντα φαρμακευτικής παραγωγής.